TÉCNICAS MACROSCÓPICAS COPROPARASITOSCÓPICAS: TAMIZADO

Objetivo:

Realizar la técnica macroscópica de tamizado, para identificar helmintos que pudiesen estar presentes en las muestras de heces.

Introducción:

El tamizado es un método físico para separar mezclas. Consiste en hacer pasar una mezcla con partículas de diferentes tamaños por un tamiz o colador. Las partículas de menor tamaño pasan por los poros del tamiz atravesándolo y las grandes quedan retenidas por el mismo.

Es un método muy sencillo utilizado generalmente en mezclas de sólidos heterogéneos. Los orificios del tamiz suelen ser de diferentes tamaños y se utilizan de acuerdo al tamaño de las partículas de una solución homogénea, que por lo general tiene un color amarillo el cual lo diferencia de lo que contenga la mezcla.

Para aplicar el método de la tamización es necesario que las fases se presenten al estado sólido. Se utilizan tamices de metal o plástico, que retienen las partículas de mayor tamaño y dejan pasar las de menor diámetro.

En parasitología la técnica de tamizado es usada para detectar a los parásitos que pudiesen quedar atrapados (trematodos, cestodos, nematodos). Esta, permite observar  directamente las características morfológicas de los parásitos adultos, enteros o fraccionados.

Sustancias:

·         Agua

·         Solución salina al 0.9%

·         Muestra biológica: heces fecales frescas

Material y equipo

·         1 coladera de tamiz fino

·         1 abatelenguas

·         1 caja Petri

·         1 pinzas

Procedimiento

1.       Colocar pequeñas porciones de materia fecal en la coladera con ayuda del abatelenguas.

2.       Dispersar la muestra con el abatelenguas y agregarle agua hasta lograr un tamizado lo más limpio posible.

3.       Revisar cuidadosamente las partículas de las heces que hayan quedado en la coladera.

4.       Los parásitos encontrados colocarlos en una caja Petri con solución salina.

5.       Se identifica la parte del parásito o el parásito completo

6.       Se reporta el género y la especie del parásito o parte del parásito. 

Resultado 

NO SE OBSERVO NINGUN HELMINTO, Y EN EL TAMIZADO SOLO QUEDARON RESTOS DE COMIDA COMO CASCARAS O FIBRAS.

 Comentario

Es una tecnica demasiado sencilla y economica, pero no tan eficiente como otras.

Método de concentración por flotación de Willis

Objetivo

Aprender a realizar diferente métodos para la identificación y estudio de los parásitos en este caso la búsqueda de huevos y quistes.

Introducción

Este método esta recomendado especialmente para la investigación de protozoarios y helmintos. Consiste en preparar la materia fecal con solución saturada de cloruro de sodio. Los huevos  y quistes de peso especifico menor que la solución saturada de cloruro de sodio tienden a subir y adherirse a un cubreobjetos colocado en contacto con la superficie del liquido.
Willis en 1921, describe este método basado en la propiedad que tienen las soluciones de densidad mayor de hacer flotar objetos menos densos.

Método de concentración por flotación simple.

·         Se usa para la búsqueda e identificación de formas parasitarias como quistes, huevos y helmintos.

·         Se evalúa una gran porción de la muestra.

·         Sensibilidad alta.

·         Fácil rápida y económica

Utilidad
Recomendado especialmente para la investigación de geohelmintos. 
Por su sencillez se puede utilizar en el campo, donde no se cuentan con demasiados materiales o reactivos para realizar otros métodos.
Los Huevos de helmintos de peso específico menor que la solución saturada de NaCl tienden a subir y adherirse a una lámina colocada en contacto con la superficie del líquido.
Este método es de alta sensibilidad en el diagnóstico de huevos livianos de helmintos: A. duodenale, N. americanus, A. lumbricoides, H. nana.
Limitaciones
los huevos y quistes de peso especifico menor que la solución saturada de cloruro de sodio tienden a adherirse a un cubreobjetos colocado

MATERIAL

·         Vaso de precipitado

·         Embudo

·         Tubo de ensaye

·         Portaobjetos

·         Cubreobjetos

·         Abate lenguas

REACTIVOS

·         Sol. Saturada de NaCl

·         Sol. De yodo lugol

PROCEDIMIENTO

1.- Tomar aproximadamente 1 gr. de heces fecales con un abate lenguas.

2.- Colocar la muestra en un vaso de precipitado y mezclar con 10 mL. de solución saturada de cloruro de sodio.

3.-En un tubo de ensaye filtre la mezclar con una gasa, llenando completamente el tubo.

4.-Coloque un portaobjetos sobre el tubo de manera que el líquido haga contacto con el portaobjetos.

5.-Esperamos de 5 a 10 minutos.

6.-Los quistes o huevos flotaran y quedaran adheridos a la cara del prtaobjetos que esta en contacto con la mezcla.

7.-Colocar una gota de yodo lugol en el porta objetos y colocar el cubreobjetos.

8.-Examinar la muestra al microscopio con el objetivo 40x, buscamos quistes o huevecillos de parásitos.

9.-Reportar los resultados   

OBSERVACIONES

En esta practica observamos huevecillos de Tricocefalos y restos de alimentos, también pudimos observar el movimiento de algunas bacterias debido a el yodo lugol, que permite su movimiento.

COMENTARIO:

Es una practica muy sencilla y economica. Aunque su desventaja es que solo se observan huevecillos que tienen una densidad menor a la del Cloruro de sodio.

PAGINAS CONSULTADAS

www.buenastareas.com

http://www.slideshare.net/monik2010/practica-2-tecnicas-coproparasitologicas

www.ucol.mx/acerca/coordinaciones/cgd/DGEMS/.../manaclinico3.p...

Metodo de concentracion por sedimentacion de Ritchie

OBJETIVO: Realizar un método de sedimentación con gran sensibilidad para detectar infecciones leves.

GENERALIDADES: En 1917 Carles y Barthelemy describieron el primer método de concentración por sedimentación utilizando solución salina, éter y formaldehído, años más tarde, en 1948 Ritchie describió un método semejante, el cual hasta la fecha se sigue utilizando. En evaluaciones comparativas con este método, se ha demostrado su utilidad para el diagnóstico de parasitosis intestinales leves o moderadas.

     El empleo de éter y formaldehído, permite con el primero, liberar las formas parasitarias de las grasas, por disolución de las mismas y con el formol se fijan y conservan. La concentración se hace por centrifugaciones sucesivas. Unas ventajas que tiene este método es concentrar y no deformar las formas parasitarias, permite el transporte y almacenamiento de la materia fecal procesada antes de ser examinada, se usa cuando se necesita una técnica para evaluación de tratamiento y determinación de frecuencia.

MATERIAL Y EQUIPO

• Microscopio

• Centrífuga

• Tubos de ensaye cónicos de 15 ml

• Gasa cortada en cuadros de 15 cm por lado

• Embudos de polietileno

• Vasos de precipitado de 50 ml

• Aplicadores de madera

• Pipetas Pasteur con bulbo

• Portaobjetos de 26 X 76 mm

• Cubreobjetos de 22 X 22 mm

• Solución salina  isotónica

• Solución de formaldehído al 10%

• Éter etílico comercial

METODO

1.- Con el aplicador de madera se coloca aproximadamente 1 gr. de la materia fecal en el vaso de precipitado, se añaden 10 ml de solución salina y se homogeniza.

2.- Se filtra la suspensión a través de la gasa colocada en el embudo, recogiendo el filtrado en el tubo cónico.

3.- Se centrífuga la suspensión durante 1 min a 2000 rpm.

4.- Se decanta el sobrenadante  y se resuspende el sedimento con solución salina, centrifugando, decantando y resuspendiendo las veces necesarias hasta que el sobrenadante sea claro.

5.- Al último sedimento se agregan 10 ml de solución de formaldehído al 10%, se mezcla y se deja reposar durante 10 min.

6.- Se añaden después 5 ml de éter, se tapan los tubos con tapones de caucho y se agitan enérgicamente durante 30 segundos.

7.- Se centrífuga durante 2 minutos a 1500 rpm.

8.- Después de centrifugar se observan 4 capas:

a)    éter en la superficial,

b)    un tapón de restos fecales,

c)    formaldehído,

d)    sedimento en el fondo del tubo, conteniendo los elementos parasitarios.

9.- Se introduce la pipeta Pasteur hasta la capa d, se extrae con cuidado una gota del sedimento y se coloca en un portaobjetos.

10.-Se le añade una gota de lugol y con uno de los ángulos del cubreobjetos, se homogeniza, cubriéndolo con el mismo.

11.-Se observa la preparación en el microscopio con objetivos de 10X y 40X.

Fuente:

http://para1.wordpress.com/2008/06/21/metodo-de-concentracion-por-sedimentacion-ritchie/

Conclusion:

Es un metodo mas elaborado, que distingue cuatro capas. Se utiliza para distinguir parasitos que causan problemas leves.

Comentario personal: 

Con respecto a lo que hicimos en el laboratorio, es mas maniobroso que las tecnicas pasadas. Aparte tiene la ventaja de que no requiere la observacion microscopica inmediata, pero la vision se dificulta con la observacion de elementos no parasitarios.

Técnica de flotación de Faust (bis)

Objetivo:
Este método nos ayudara a encontrar huevecillos mediante el uso de la densidad.

Introducción:
En este método se utiliza solución de Zn, cuya densidad especifica es de 1.180 (33%), que conforma un medio de densidad mas alta que la de los huevos: Necator 1.055, Tricocefalo 1.150, Ascaris fértil 1.110 y facilita que los huevos livianos de estos helmintos, se concentren y floten.
La concentración adecuada aconsejada es la que usa como reactivo una solución acuosa de sulfato de Zn al 33% con una densidad de 1.180, el agua utilizada diluye y lava la materia fecal. El filtrado con grasa doblada evita que los detritos gruesos traspasen las paredes, la centrifugacion enriquece en delgada película la superficie del liquido centrifugado con los huevos livianos de algunos helmintos.

Material:

·         Porta objetos.

·         Cubreobjetos.

·         Gasas.

·         Tubos de ensayo.

·         Solución acuosa de sulfato de Zn.

Técnica:

1. Mezclar bien una porción de materia fecal para preparar una superficie en diez partes de agua destilada.
2. Filtrar la suspensión a través de una gasa doblada en cuatro, sobre un tubo de centrifuga, ayudándose con un embudo pequeño.
3. Centrifugar el filtrado a 2500 rpm por 1 min.
4. Decantar el liquido sobredrenante y completar con agua hasta igualar la medida anterior, centrifugar nuevamente. Resuspender el sedimento.
5. Repetir el procedimiento 2 veces hasta que el liquido sobredrenante este listo.
6. Decantar nuevamente el liquido sobredrenante reemplazándolo por igual cantidad de Sulfato Zn al 33%. Mezclar bien la solución con el sedimento. Centrifugar durante 1 min a 1500 rpm.
7. Tomar 3-4 gotas de las partículas que flotan en la superficie del liquido. Colocarlos en un portaobjeto y mezclarla con 1-2 gotas de lugol, colocar el cubreobjeto.
8. Examinar al microscopio y reportar los resultados.

Conclusión:

Este es un método muy efectivo para huevecillos con densidad menor a 1.180, aunque es un poco mas selectivo, y a través del lugol se pueden lograr ver de mejor calidad.
Comentario personal:
Es un metodo muy facil y practico, pero mas complejo que otros.

Técnica de flotación de Faust

OBJETIVO

Buscar en las muestras biológicas la presencia de los distintos parásitos para tener un conocimiento más amplio sobre ellos.

FUNDAMENTO

Las parasitosis intestinales son un conjunto de padecimientos causados principalmente por protozoarios y helmintos y considerados un problema de salud pública.

El examen coproparasitoscopico (CPS) es un conjunto de técnicas diagnósticas que constituyen la indicación para la identificación de la mayoría de las enteroparasitosis causadas por protozoarios o helmintos. Su eficacia y sensibilidad para establecer un diagnóstico correcto dependen de la adecuada indicación y preparación de la muestra, los datos clínicos y antecedentes de interés que sean aportados al laboratorio y de su correcta y completa ejecución con examen directo microscópico.

Faust es el método mas usado y efectivo, en este se precipitan los parásitos por centrifugación después de haber filtrado la muestra.

· Es un examen coproparasitoscopico cualitativo de concentración por centrifugación y flotación.

·Hace una buena concentración de quistes huevos y larvas.

La técnica de Faust, hace una buena concentración de quistes, huevos y larvas; es la técnica preferida por la generalidad de los laboratorios. Las formas parasitarias son encontradas con facilidad pues las preparaciones quedan con pocos artefactos. Los elementos parasitarios son recuperados de la capa superficial y los residuos se mantienen en el fondo del tubo. Con estas técnicas los preparados son más limpios que los obtenidos por sedimentación.

MATERIAL

·         Porta objetos.

·         Cubreobjetos.

·         Gasas.

·         Tubos de ensayo.

·         Solución acuosa de sulfato de Zn.

TECNICA

1) Mezclar bien una porción de materia fecal para preparar una superficie en 10 partes de agua destilada.

2) Filtrar la suspensión a través de una gasa doblada en cuatro, sobre un tubo de centrifuga, ayudándose con un embudo pequeño.

3) Centrifugar el filtrado a 2500 rpm por 1min.

4) Decantar el liquido sobrenadante y completar con agua hasta igualar la medida anterior, centrifugar nuevamente. Re suspender el sedimento.

5) Repetir el procedimiento hasta 2 veces hasta que el liquido sobrenadante este listo.

6) Decantar nuevamente el líquido sobrenadante remplazándolo por igual cantidad de solución de sulfato de Zn al 33%. Mezclar bien la solución bien la solución con el sedimento. Centrifugar durante 1 minutos por 1500 rpm.

7) Tomar de 3-4 gotas de las partículas que flotan en la superficie del liquido. Colocarlos en un porta-objeto y mezclar con 1-2 gotas de lugol, colocar cubre-objeto

8) Examinar al microscopio y reporte sus resultados.

(resultados obtenidos)

Método indicado para el diagnostico de huevos livianos de helmintos (Necator, Tricocefalos, Áscaris, H.nana).

Conclusion: 

Al parecer aun no hemos encontrado algun parasito, pero a traves de la practica consecutiva de este metodo, alcanzaremos la observacion de alguno de ellos.

COMENTARIO PERSONAL: 

Este es un metodo mas complejo que el directo, pero es un poco mas exacto. Me sorprendio el uso de la densidad para encontrar parasitos.

FUENTE CONSULTADA:

http://www.saberdeciencias.com.ar/index.php/apuntes-de-parasitologia/159-diagnostico-de-laboratorio-de-las-parasitosis

Coproparasitoscópico directo o fresco.

Coproparasitoscópico directo o fresco.

Practica no. 1

Objetivo: Identificar las diferentes formas parasitarias mediante la observación microscópica.

Introducción:
Como sabemos uno de los primeros microscopistas fue Antón Van Leewenhoek y a mediados del siglo XVII fue el primero en utilizar este método al observar directamente en sus propias heces fecales,trofozoitos de Giardia lamblia.
El método que necesita menos equipo y el más sencillo de realizar, corresponde a las preparaciones húmedas, que se hacen directamente con muestras de heces. Para las preparaciones directas de heces frescas o no preservadas, los exámenes ordinarios se hacen con solución salina isotónica y lugol. Si se emplean heces preservadas, el formol sirve de diluyente.
Las preparaciones no teñidas son de especial valor para el estudio de parásitos vivos, como trofozoitos de protozoarios móviles, huevos de helmintos y larvas de nematodos. El lugol se emplea principalmente para la búsqueda e identificación de quistes y larvas, con base a sus características.
La mezcla normal en el tracto intestinal por lo general no asegura una distribución uniforme de trofozoitos de protozoarios móviles, huevos de helmintos y larvas de nematodos. Sin embargo el examen de materia fecal directo o en fresco puede revelar o no parásitos, dependiendo de la intensidad de la infección.

Fundamento:
La solución salina isotónica dá las condiciones adecuadas para que la célula se mantenga viva. El medio ideal para todo tipo de parásito que pueda encontrarse en las muestras de heces, en cualquier etapa de su desarrollo, es la solución salina fisiológica, y el lugól en la práctica ha demostrado su eficacia para la tinción e identificación de parásitos intestinales.

MATERIAL.
- Muestra fecal
- Aplicadores de madera
- Portaobjetos de 25 X 76 mm.
- Cubreobjetos
- Solución salina isotónica
- Lugól parasitológico.

PROCEDIMIENTO:
- En un portaobjetos colocar una gota de solución salina isotónica
- Con la punta del aplicador tomar una pequeña muestra de aproximadamente 1 a 4 mg. de heces, en muestras con moco y sangre elegir esta parte para estudiar.

- Mezclar , procurando hacer una suspensión en preparación delgada y no un frotis.
- Quitar de la suspensión fibras y otros fragmentos grandes.
- Colocar el cubreobjetos lentamente procurando no dejar burbujas

- Examinar al microscopio en forma sistemática, a seco débil y a seco fuerte.

- Repetir la operación con una gota de lugól en lugar de la de solución salina.

Resultados: 
Nuestro paciente revelo no tener ningun parasito, y durante el observamiento solo se lograron ver fibras vegetales y almidon.

PRECAUCIONES.
- Una preparación satisfactoria debe tener densidad ligeramente opaca, pero ser lo bastante delgada que permita leer las letras a través de esta.
- Se deben ver perfectamente los elementos en la preparación, sin que se dificulte la observación por el exceso de burbujas y detritos microscópicos.
- En heces líquidas y semilíquidas hay que seleccionar el moco sanguinolento o los esfácelos delgados del tejido y en heces formadas, hacer raspados para obtener material de la superficie en varias partes de la masa fecal.
- Utilizar intensidad lumínica baja.
- Examinar por lo menos tres muestras antes de considerar negativos los resultados.
- La materia fecal es potencialmente infectante, por lo que se deberá tener los cuidados necesarios para su manejo.

http://www.facultadcienciasquimicas.buap.mx/ligas/acredita/QFB/data/4_2%20Curriculum/4.2.10%20%20Actas%20de%20%C3%A1reas%20Programas%20de%20asig%20y%20Manuales%20Lab/Manuales%20de%20Laboratorio/An%C3%A1lisisCl%C3%ADnicosLab-pdf/LAB%20DE%20PARA%20I.pdf

Hematocrito

El índice hematocrito es el volumen que ocupan los elementos celulares de la sangre. Los eritrocitos son las células que constituyen casi todo el volumen, mientras que los leucocitos y las plaquetas ocupa una parte mínima. El hematocrito se expresa en un porcentaje.

En el metódo de microhematocrito se llenan capilares heparinizados de 7mm de longitud y de 1mm de diámetro interno. El capilar se llena con capilaridad a partir de una punción o de sangre venosa obtenida con EDTA. Se tapa el extremo vacío con pasta para modelar. El tubo lleno se coloca en una ranuras radiales de la centrífuga de microhematocrito, con el extremo sellado lejos del centro. Se centrífuga durante 5 minutos a 10.000-12.000 g. Una vez centrifugados, el volumen celular se lee con unas escalas de plástico graduadas.

Para obtener unos buenos resultados, es fundamental que la duracion  y velocidad de la centrifugacion sean adecuadas. Otras causas posibles de error son mezclar deficientemente la sangre al cargar los capilares y la lectura iincorecta de estas.

Los analizadores hematologicos determinan el hematocrito de forma indirecta a partir del volumen corpuscular medio y el recuento eritrocitario. La principal diferencia entre el hematocrito determinado por centrifugacion y el que se obtiene indirectamente por medios electronicos es que este corresponde al denominado hematocrito real, es decir, al que no considera el efecto del plasma atrapado entre los eritrocitos, que debe tenerse en cuenta al determinar el hematocrito por centrifugación.

Los valores de referencia del hematocrito son del 40 al 54% en los varones y del 37 al 47% en mujeres. Un valor por debajo del limite de referencia para la edad y el sexo indica anemia, mientras que un valor por encima de el limite señala policitemia.

 

 

Uso del microscopio.

Objetivo:
Manipular de forma correcta el microscopio para realizar observaciones de forma adecuada y de buena calidad.
Materiales:

• Vidrio de reloj.
• Bisturí.
• Microscopio.
• Portaobjetos.

Introduccion:

El microscopio es un instrumento que nos permite ver aumentados los objetos que no pueden ser observados a simple vista.
Desde su invención se han podido hacer estudios más detallados de las estructuras de los seres vivos.
Existen diversas clases de microscopios, según la conformación, la naturaleza de los sistemas de luz y otros elementos utilizados para obtener las imágenes.

Microscopio óptico o compuesto.
Consta de un conjunto de lentes dispuestas entre la muestra que queremos observar,  y nuestro ojo. Su acción combinada produce un aumento total de la imagen. Normalmente tiene cuatro aumentos posibles: 4x, 10x, 40x y 100x, siendo el 4x el menor aumento y el x100 el mayor.
 

PARTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO O COMPUESTO

OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo.
OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta.
CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.
DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
Sistema mecánico
SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.
PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación.
CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular, …..
REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos.
TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que consigue el enfoque correcto.

 

PROCEDIMIENTO:

1. Cortar un pequeño pedazo de cebolla, de preferencia  la capa mas fina.
2. Iniciar la observacion en el microscopio.
3. Se coloca el objetivo de menor aumento en pocision de empleo y se baja la platina completamente.
4. Colocar el portaobjeto con cebolla sobre la platina.
5. Comenzar la observacion de menor aumento parra ver en mayor espacio. Para realizar el enfoque: Acercar al maximo la lente del objetivo al portaobjetos, empleando el tornillo macro, esto debe de hacerse mirando directamente a través del ocular.
6. Pasar al siguiente objetivo y la imagen debe de estar bien definida, se enfoca con el micro.
7. Una vez finalizada la observacion se baja la platina completamente y se coloca el objetivo de menor aumento, en este momento se puede retirar el portaobjetos.    

CONCLUSIONES:

Sirve para ver estructuras muy pequeñas que la resolución del ojo no puede distinguir.

Jose Ventura Campos Rodríguez.